Amici della Scienza

Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi

Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi
La microscopia crioelettronica rompe una barriera chiave che consentirà di sondare il funzionamento delle proteine ​​con dettagli senza precedenti.

Una tecnica rivoluzionaria per l’imaging di molecole nota come microscopia crioelettronica ha prodotto immagini ancora più nitide e, per la prima volta, ha individuato singoli atomi in una proteina.

Raggiungendo la risoluzione atomica utilizzando la microscopia crioelettrica-elettrone (crio-EM), i ricercatori saranno in grado di comprendere, con un dettaglio senza precedenti, il funzionamento di proteine ​​che non possono essere facilmente esaminate con altre tecniche di imaging, come la cristallografia a raggi X.

Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi 1
Una mappa Cryo-EM della proteina apoferritina. Credito: Paul Emsley / MRC Laboratory of Molecular Biology

La scoperta, segnalata da due laboratori alla fine del mese scorso, consolida la posizione di cryo-EM come strumento dominante per mappare le forme 3D delle proteine, affermano gli scienziati. In definitiva, queste strutture aiuteranno i ricercatori a capire come funzionano le proteine ​​in medicina e ci condurranno a farmaci con minori effetti collaterali.

“È davvero una pietra miliare, questo è certo. Non c’è davvero più nulla da risolvere. Questa è stata l’ultima barriera di risoluzione “, afferma Holger Stark, biochimico e microscopista elettronico del Max Planck Institute for Biophysical Chemistry di Göttingen, in Germania, che ha guidato uno degli studi. Gli altri erano guidati da Sjors Scheres e Radu Aricescu, biologi strutturali del Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB) di Cambridge, Regno Unito. Entrambi gli studi sono stati pubblicati sul server di preprint bioRxiv il 22 maggio.

La risoluzione atomica “è una vera pietra miliare”, aggiunge John Rubinstein, biologo strutturale dell’Università di Toronto in Canada. Ottenere strutture a risoluzione atomica di molte proteine ​​sarà ancora un compito difficile.

Rompere i confini

Cryo-EM è una tecnica utilizzata da decenni che determina la forma dei campioni congelati dal flash lanciando elettroni e registrando le immagini. I progressi nella tecnologia per il rilevamento degli elettroni che rimbalzano consiste nel software di analisi delle immagini collezionando delle “rivoluzioni di risoluzione” iniziata intorno al 2013.

Ciò ha portato a strutture proteiche più nitide, buone come quelle ottenute dalla cristallografia a raggi X, una tecnica più vecchia che rileva le strutture dai modelli di diffrazione realizzati dai cristalli proteici quando sono bombardati dai raggi X.

Grafico a linee che mostra come la microscopia crioelettronica può ora risolvere le caratteristiche a livello atomicoI successivi progressi hardware e software hanno portato a miglioramenti nella risoluzione delle strutture crio-EM. Ma gli scienziati hanno dovuto fare affidamento gran parte sulla cristallografia a raggi X per ottenere strutture a risoluzione atomica. Tuttavia, i ricercatori possono impiegare mesi o anni a far cristallizzare una proteina e molte proteine ​​importanti dal punto di vista medico non formano cristalli utilizzabili; cryo-EM, invece richiede solo che la proteina sia in una soluzione purificata.

Le mappe a risoluzione atomica sono abbastanza precise da discernere in modo inequivocabile la posizione dei singoli atomi in una proteina, con una risoluzione di circa 1,2 ångstrom (1,2 × 10 –10 m). Queste strutture sono particolarmente utili per capire come funzionano gli enzimi e usare quelle intuizioni per identificare i farmaci che possono bloccare la loro attività.

Per spingere la crio-EM alla risoluzione atomica, i due team hanno lavorato su una proteina che immagazzina ferro chiamata apoferritina. A causa della sua stabilità simile a una roccia, la proteina è diventata un banco di prova per il crio-EM: una struttura della proteina con una risoluzione di 1,54 ångstrom, il record precedente.

Stark ritiene che la fusione delle tecnologie potrebbe spingere le risoluzioni a circa 1 ångström – ma non molto oltre. “Al di sotto di 1 Å è quasi impossibile arrivarci”, afferma. Ottenere una struttura del genere con la tecnologia all’avanguardia esistente richiederebbe “diverse centinaia di anni di registrazione dei dati e una quantità non realistica di potenza di calcolo e capacità di archiviazione dei dati”, stima il suo team.

Microscopia crioelettronica

Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi 2
La proteina GroEL sospesa in ghiaccio amorfo, osservata a un ingrandimento di 50.000x

La microscopia crioelettronica, è un tipo di microscopia elettronica a trasmissione in cui il campione viene studiato a temperature criogeniche (generalmente alle temperature dell’azoto liquido).

L’utilità della microscopia crioelettronica deriva dal fatto che consente l’osservazione di campioni non colorati o fissati in alcun modo, mostrandoli nel loro ambiente nativo, questo in contrasto con la cristallografia a raggi X, che richiede la cristallizzazione del campione, che può essere difficile nel caso di macromolecole, e la collocazione dello stesso in ambienti non fisiologici, che possono occasionalmente portare a cambiamenti conformazionali delle molecole.

Si tratta pertanto di una tecnica particolarmente utile in biologia strutturale dove è fondamentale poter osservare le macromolecole biologiche nella loro conformazione nativa.

Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi 3
Immagine HRTEM del grafene a singolo strato acquisito a 80 kV.
Sintesi di grafene mediante decomposizione catalizzata da cobalto di metano in CVD potenziato con plasma: ottimizzazione di parametri sperimentali con metodo Taguchi HA Mehedi, B Baudrillart, D Alloyeau, O Mouhoub, C Ricolleau, VD Pham, C Chacon, A Gicquel, J Lagoute, S Farhat
Journal of Applied Physics, 120 (6), 065304 (1-11)

La risoluzione delle immagini ottenute tramite microscopia crioelettronica è in costante aumento e nel 2014 sono state ottenute alcune strutture a risoluzione quasi atomica, incluse quelle di virus, ribosomi, mitocondri, canali ionici e complessi enzimatici di minimo 170 kDa a una risoluzione di 4,5 Å.

Nel 2015 Bridget Carragher e collaboratori sono riusciti a ottenere una struttura con una risoluzione inferiore ai 3 Å, elevando così la microscopia crioelettronica a strumento comparabile e potenzialmente superiore alle tradizionali tecniche di cristallografia a raggi X.

Nel giugno dello stesso anno una struttura di una beta-galattosidasi batterica è stata resa nota con una risoluzione di 2.2 Å. Un tipo di microscopia crioelettronica è la tomografia crioelettronica, che permette di realizzare una ricostruzione tridimensionale di un campione da immagini bidimensionali ottenute a varie angolazioni.

Sviluppo

Richard Henderson ha tracciato il cammino verso la cryo-EM nel 1975, quando utilizzò la microscopia elettronica per determinare un modello tridimensionale di batteriorodopsina sovrapponendo più immagini ottenute con deboli raggi di elettroni.

Questo studio mostrò che la microscopia elettronica avrebbe potuto fornire immagini dettagliate quanto quelle della cristallografia a raggi-X, che era la tecnica a massima risoluzione, al tempo. In quel decennio, Joachim Frank, allora al New York State Dept. of Health, sviluppò la tecnologia di image-processing per convertire la convenzionale microscopia elettronica 2D in una tecnica utile ad ottenere strutture 3D.

Henderson ha anche contribuito al progresso delle tecniche di image processing. Nei primi anni Ottanta, Jacques Dubochet concepì delle metodiche per congelare rapidamente dei campioni biomolecolari così da proteggerli dai danni elettronici e comunque lasciarli idratati, anche nel vuoto, mantenendo la loro forma nativa.

Dal 1990, la tecnologia migliorò a tal punto che Henderson riuscì ad ottenere la prima struttura cryo-EM ad alta risoluzione. Il suo target, la batteriorodopsina, ha una struttura molto ordinata e questo ha facilitato l’ottenimento di un risultato ad alta risoluzione; sarebbe stato chiaramente più complesso con altre biomolecole.

Jacques Dubochet, Joachim Frank e Richard Henderson hanno ottenuto il premio Nobel 2017 per la chimica “per aver sviluppato la microscopia crioelettronica per determinare in alta definizione le strutture delle biomolecole in soluzione”.

 

Riferimenti e approfondimenti

  1. Yip, KM, Fischer, N., Paknia, E., Chari, A. & Stark, H. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.21.106740 (2020).
  2. Nakane, T. et al. Preprint su bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.05.22.110189 (2020).
  3. Kato, T. et al. Microsc. Microanal. 25 (S2), 998–999 (2019).
  4. Uchański, T. et al. Preprint su bioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/812230v1 (2020).
  5. Naydenova, K., Peet, MJ & Russo, CJ Proc. Natl Acad. Sci. USA 116 , 11718-11724 (2019).
  6. Amici della Scienza
5 1 vote
Article Rating
Summary
Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi
Article Name
Microscopia crioelettronica vede per la prima volta i singoli atomi
Description
La microscopia crioelettronica rompe una barriera chiave che consentirà di sondare il funzionamento delle proteine ​​con dettagli senza precedenti.
Admin
Amici della Scienza
Amici della Scienza
https://www.focusuniverse.com/wp-content/uploads/2020/05/cats-1.png
Subscribe
Notificami
guest
0 Commenti
Inline Feedbacks
View all comments
Translate »
0
Would love your thoughts, please comment.x
()
x